# Antioxidant and Anti-inflammatory

 

1. 서론

 

최근 합성 항산화제가 인체에 심각한 부작용을 일으킬 수 있다고 보고됨에 따라 천연소재로부터 분리된 다양한 활성 성분에 대한 연구가 활발히 수행되고 있다¹⁾. 다양한 식물의 활성 성분은 피부세포에 free radical과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제 또는 제거시켜 산화에 의한 손상을 방지하는 역할을 한다²⁾. 산화에 의한 손상은 주로 ROS에 의해 발생하며³⁾ 이러한 ROS 증가는 피부의 형태학적 그리고 화학적인 변화를 유발시켜 염증을 촉진시킨다⁴⁾.

 

이처럼 일련의 산화반응과 염증반응은 밀접한 관련이 있으며 산화반응을 감소시켜줄 수 있는 항산화 물질은 염증 또한 감소시키므로 생체 노화를 억제 하기 위해서는 항산화 물질의 개발이 중요하다고 할수 있다⁵⁾. 본 연구에서는 전통식물 약재로 미국 북미에서 다양한 유형의 감염과 상처 치료에 사용되어진 바 있으며⁶⁾, 최근 COVID-19에 관한 연구로⁷⁾ 활용가치가 높아지고 있는 Echinacea의 항산화와 항염활성 효과를 확인했다.

 

2. 연구방법

2-1. 추출물

E. angustifolia는 열수 추출 방식을 이용해 정제수와 1%의 원물 비율로 80℃에서 유효성분 추출 후 정량을 통해 일정한 농도로 사용했다. 동결건조 후 항산화능 실험은 70% ethanol을 용매로 재용해시켜 실험을 진행했다. 세포실험은 dimethyl sulfoxide(DMSO, sigma)를 용매로 재용해시킨 뒤 원심분리기(3000 × G, 15min)로 불용성 성분을 제거하고 본 실험에 사용했다.

 

2-2. DPPH 라디칼 소거능 측정

실험에는 ethanol 70%를 용매로 1%(w/v) DPPH 용액을 사용했다. DPPH 용액 1.0mL와 E. angustifolia 추출물 1.0mL를 혼합하고 30분간 반응시킨 후 UV-Vis Spectrophotometer(Ultrospec 3100 pro, GE Healthcare, USA)를 이용해 520nm에서의 흡광도를 측정했다. 실험 결과는 환원된 DPPH 용액과 추출물의 측정된 흡광도를 제외하고 ascorbic acid의 EC50을 측정한 후 비교해 작성했다.

 

그림1 DPPH radical scavenging rate of Echinacea angustifolia extract.

 

 

2-3. ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 용액의 흡광도는 740nm에서 0.7이 되도록 설정했다. ABTS 용액 1.0mL와 500μg/mL를 기준으로 2배씩 희석한 E. angustifolia 추출물 1.0mL를 혼합하고 30분간 반응시킨 후 UV-Vis Spectrophotometer 이용해 740nm에서의 흡광도를 측정했다. 실험결과는 환원된 ABTS 용액과 추출물의 흡광도를 제외하고 ascorbic acid의 EC50을 측정한 후 비교해 작성했다.

 

그림2 ABTS radical scavenging rate of Echinacea angustifolia extract.

 

 

2-4. FRAP 측정

0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.6) 2.5mL에 E. angustifolia 추출물 2.5mL를 혼합하고 그 후 10% potassium ferricyanide 2.5ml를 첨가해 50℃에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 시료는 10% trichloroacetic acid(TCA) 2.5ml를 넣은 뒤 원심분리(3000×G, 15min)해 침전물을 제거했다. 추출물의 환원력 평가에는 침전물이 제거한 용액 1mL와 0.1% ferric chloride 용액 0.2mL를 혼합한 후 700nm에서의 흡광도를 측정했다.

 

2-5. 폴리페놀 함량 측정

E. angustifolia 추출물 1.0mL에 증류수로 10배 희석된 Folin-Ciocalteu reagent 0.1mL를 혼합한 뒤 실온 에서 5분간 반응시켰다. 이 후 1.0mL의 CaCO3(5%, w/v)를 주입해 30분간 반응시키고 760nm에서 흡광도를 측정했다. 폴리페놀 농도는 gallic acid를 이용한 standard curve를 이용해 환산했다.

 

2-6. 플라보노이드 함량 측정

E. angustifolia 추출물 1.0mL에 NaNO2(5%, w/v) 0.3 mL를 첨가 후 실온에서 5분간 반응시켰다. 이 후 AlCl3(2%, w/v) 0.5mL를 주입해 6분간 반응시키고 1 M NaOH 0.5mL를 첨가해 중화한 후 510nm에서의 흡광도를 측정했다. 플라보노이드 농도는 quercetin을 기준으로 standard curve를 이용해 작성했다.

 

2-7. 세포 독성 측정

RAW 264.7을 96 well plate에 well 당 1×104 cell을 주입해 24시간 배양했다. 배양 끝난 후 상층액을 제거 하고 200μg/mL를 기준으로 처리한 다양한 농도의 E. angustifolia 추출물을 48시간 동안 배양했다. 그 후 상층액을 제거하고 MTT용액 5mg/mL를 첨가한 뒤 농도 5%의 CO2와 온도 37℃의 환경에서 결정화시켰다. 각 well에 생성되어 있는 결정이 손상되지 않도록 상층액을 제거한 뒤 결정을 DMSO로 녹여 540nm 파장에서 흡광도를 측정했다.

 

2-8. NO 생성 억제능 측정

E. angustifolia의 NO 측정을 위해 RAW 264.7을 96 well plate에 well 당 1×104cell을 농도로 seeding했으며 온도 37℃, 5% CO2 조건에서 1일간 세포를 배양했다. 배양이 끝난 후 상층액을 제거한 뒤 E. angustifolia 추출물 100μg/mL를 기준으로 다양한 농도로 처리 후 LPS(lipopolysaccharide, Sigma, USA)의 농도가 1μg/mL가 되도록 처리해 48시간 동안 배양했다. 그 후 상층액을 회수해 Griess reagent 100μL와 상층액 100μL를 혼합해 E. angustifolia 추출물과 대조군 배양 상층액의 NO 농도를 측정했다.

 

3. 실험결과

3-1. DPPH 라디칼 소거능

E. angustifolia 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 계산한 결과는 그림1과 같다. 실험 결과 400μg/mL 농도에서 100.00±0.97%, 200μg/mL 농도에서 91.87±2.28%, 100μg/mL 농도에서 61.21±2.65%, 50μg/mL 농도에서 39.14±2.43%, 25μg/mL 농도에서 14.52±2.54%의 DPPH 라디칼 소거능이 나타났다. 한편, 이를 바탕으로 EC50을 계산한 결과 ascorbic acid는 20.87μg/mL, 본 추출물은 70.60μg/mL로 나타나 ascorbic acid와 비교 시약 27.98%의 항산화능을 보였다.

 

3-2. ABTS 라디칼 소거능

E. angustifolia 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 계산한 결과는 그림2와 같다. 실험 결과 400μg/mL에서 99.00±0.36%, 200μg/mL에서 94.03±1.06%, 100μg/mL에서 50.60±2.95%, 50μg/mL 에서 16.28±1.16%, 25μg/mL에서 6.18±0.52%의 ABTS 라디칼 소거능이 나타났다. EC50 계산 결과 ascorbic acid의 수치는 20.11μg/mL, 본 추출물은 99.11μg/mL로 나타나 ascorbic acid와 비교 시 약 20.29% 항산화능을 보였다.

 

3-3. FRAP

E. angustifolia 추출물의 FRAP 측정 결과 0.166±0.005로 나타났으며 ascorbic acid의 standard curve를 바탕으로 E. angustifolia 추출물의 1mg의 FRAP은 ascorbic acid 0.421±0.013μg의 FRAP과 같음을 알 수 있었다.

 

3-4. Polyphenol과 flavonoid 함량

표1은 E. angustifolia 추출물의 폴리페놀 함량과 플라 보노이드 함량을 계산한 결과이다. 폴리페놀의 경우 104.42±3.21μg/mL으로 나타났으며 플라보노이드의 경우 62.86±2.26μg/mL으로 나타났다.

 

표1 Polyphenol and flavonoid content in Echinacea angustifolia extract

 

 

3-5. 세포 독성

실험 결과는 표2와 같으며 200μg/mL 농도에서 95.32±1.75%, 100μg/mL 농도에서 94.75±2.17%, 50μg/mL 농도에서 96.37±1.39%, 25μg/mL 농도에서 97.58±1.91%, 12.5μg/mL 농도에서 98.97±1.29%의 세포 생존률이 나타났다.

 

표2 Cytotoxicity of RAW 264.7 of Echinacea angustifolia extract cell survival rate (%)

 

 

3-6. NO 생성 억제능

표3은 염증과 관련된 지표인 NO의 감소률을 계산한 결과이다. 200μg/mL에서 51.07±4.58%, 100μg/mL에서 38.20±3.79%, 50μg/mL에서 17.17±3.98%, 25μg/mL에서 12.02±2.65%, 12.5μg/mL에서 0.43±2.19% 의 염증 억제율이 나타났다.

 

표3 NO concentration rate of RAW 264.7 of Echinacea angustifolia extract

 

 

4. 결론

E. angustifolia 추출물이 화장품 원료로서 효능을 확인한 결과 DPPH와 ABTS 실험에서는 ascorbic acid/g와 비교 시 각각 약 27.98%의 항산화능과 약 20.29%의 항산화능을 보였다. FRAP에서는 E. angustifolia 추출물 1mg의 환원력과 ascorbic acid 0.412±0.013μg의 환원력이 같음을 확인했다. 폴리페놀 농도는 104.42±3.21μg/mg이었고 플라보노이드 농도는 62.86±2.26μg/mg 이었다.

 

식품의약품안전처 기준에 따라 모든 실험 농도에서 독성이 나타나지 않은 것을 확인했으며 항염활성 실험에서도 농도에 따라 염증반응을 감소시키는 동시에 200μg/mL에서 51.07±4.58%의 염증 억제능이 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 E. angustifolia 추출물은 천연 항산화제 뿐 아니라 항염 물질로서 피부노화와 피부질환 등을 개선할 수 있는 기능성화장품 소재로서의 활용 가능성이 높음을 시사한다.

 

문의처
meeth

TEL : 02-6339-9758
주소 : 서울특별시 강남구 봉은사로 84길 7 3층

홈페이지 : https://www.meeth.jp/