# Geranium Maculatum Extract(와일드제라늄 추출물)의 항산화, 미백, 항염효과

 

1. 서론

최근 들어 건강한 피부에 대한 관심이 높아지고 있으며 이러한 사회적 트렌드에 따라 국내 화장품 시장도 크게 성장하고 있다¹⁾. 식품의약품안전처(2021)에 따르면, 화장품 수출액은 8.94조 원으로 국내 총 수출의 1.40%를 차지하며 연평균 성장률(2011~2020)은 29.19%로 나타났다²⁾.

 

특히 친환경적인 천연유래 성분에 대한 소비자들의 관심이 높아지면서 다양한 브랜드에서 천연 유래 원료를 사용한 기능성화장품을 출시하고 있다. 하지만 현재 천연 유래 원료에 대한 연구는 매우 한정적이며 기능성화장품 소재로서 활용하기 위한 많은 연구가 필요한 시점이다³⁾. 이에 본 연구에서는 기능성화장품 소재로서 와일드제라늄 추출물(Geranium Maculatum Extract)의 활용 가능성을 연구했다.

 

2. 실험 방법

2-1. 추출물

 

본 실험에 사용한 와일드제라늄 추출물은 정제수와 원물은 1%의 비율로 80℃ 열수추출 방식을 통해 추출해 제조했다. 항산화능 실험과 세포 실험을 위해 동결 건조로 건조중량을 측정했으며 이를 증류수로 재용해시킨 뒤 syringe filter(PVDF, 0.2μm)를 통해 균, 불용물을 제거했다.

 

2-2. DPPH 라디컬 소거능 측정

 

DPPH assay 측정을 위해 70% ethanol을 용매로 DPPH를 1%(w/v)가 되도록 녹인 뒤 filter paper를 이용해 불용된 DPPH를 제거했다⁴⁾. 이 후 용액의 520nm 흡광도가 1.00이 되도록 70% ethanol로 다시 희석해 사용했다. 500μg/mL를 기준으로 2배씩 희석해 만들어진 다양한 농도의 추출물 1.0mL와 DPPH 용액 1.0mL를 혼합 후 30분간 반응시켰다.

 

2-3. ABTS 라디컬 소거능 측정

ABTS assay 측정을 위해 ABTS 용액은 증류수를 용매로 7mM ABTS를 녹인 뒤 2.45mM potassium persulfate를 녹여 12 시간 동안 ABTS의 발색이 일어나도록 했다^5). 발색이 끝난 ABTS 용액의 740nm 흡광도가 0.7이 되도록 희석해 사용했다. 500μg/mL를 기준으로 2배씩 희석해 만들어진 다양한 농도의 와일드제라늄 추출물 1.0mL와 ABTS 용액 1.0mL를 혼합 후 30분간 반응시켰다.

 

2-4. FRAP 측정

추출물의 환원력을 측정하기 위해 산화된 철 이온을 이용했으며 실험에는 0.5mg/mL 농도로 희석한 와일 드제라늄 추출물을 사용했다¹⁴⁾. 추출물 2.5mL과 0.2M 인산염 완충용액(pH 6.6) 2.5mL를 혼합해 일정한 pH가 나타나도록 한 뒤 10% 페리시안화 칼륨용액 2.5ml를 주입해 50℃에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 시료는 10% trichloroacetic acid 2.5ml를 넣은 뒤 원심분리(3000 × G, 15min)해 침전물을 제거했다. 침전물이 제거 된 용액 1mL와 0.1% ferric chloride 용액 0.2mL를 혼합시킨 후 700nm에서 흡광도를 측정해 환원력을 평가했다.

 

2-5. 폴리페놀 함량 측정

와일드제라늄 추출물 1.0mL와 증류수로 10배 희석된 Folin-Ciocalteu reagent 0.1mL를 혼합한 뒤 5분 동안 실온에서 방치한 후 CaCO3(5%, w/v) 1.0mL를 주입했다.

 

2-6. 플라보노이드 함량 측정

와일드제라늄 추출물 1.0mL에 NaNO2(5%, w/v) 0.3mL를 주입한 뒤 5분 동안 실온에서 방치한 후 AlCl3(2%, w/v) 0.5mL를 주입한 뒤 6 분간 방치했다. 이 후 1 M NaOH 0.5mL를 주입해 중화시킨 뒤 510nm에서의 흡광도를 측정했다.

 

2-7. 세포 독성 측정

세포 독성 실험에는 B16F10 cell과 RAW 264.7 cell을 사용했다. 세포 배양 배지로는 DMEM broth(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, GE healthcare, USA)를 사용했으며 FBS(fetal bovine serum, Sigma, USA)를 각각 5%, 10%를 첨가해 제조했다. 항생물질로 Penicillin-Streptomycin(100X) (Sigma, USA)을 사용했다. 추출물은 DMSO에 용해시켜 처리했다.

 

세포 독성의 측정에는 MTT assay를 실시했다. 먼저 배양된 세포를 96 well plate에 well 당 5.0×10 4 cell을 주입해 24시간 배양했다. 배양이 끝난 후 상층액을 제거한 뒤 와일드제라늄 추출물을 100μg/mL를 기준으로 2배 다단희석한 농도로 처리한 뒤 72시간 동안 배양했다. 2차 배양 후 상층액을 제거하고 MTT 용액(5mg/mL)를 가해준 뒤 온도 37℃, CO₂ 농도 5% 의 환경에서 MTT를 결정화시켰다. 각 well에 생성된 결정이 제거되지 않도록 상층액을 제거한 뒤 결정을 DMSO로 녹여 540nm 파장에서의 흡광도를 측정했다.

 

2-8. 미백 활성

B16F10 cell을 사용해 멜라닌 생성량 측정 실험을 진행했다. FBS 5%를 첨가해 제조했으며 항생물질로는 Penicillin-Streptomycin(100X)을 사용했다. 추출물은 DMSO에 용해시켜 처리했다.

 

멜라닌 측정을 위해 B16F10을 96 well plate에 각 well 당 5.0×10 4 cell 씩 seeding하여 1일간 37℃, 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양했다. 배양이 끝난 후 상층 액을 제거한 뒤 와일드제라늄 추출물을 100μg/mL를 기준으로 2배 다단희석한 농도로 처리하고 ɑ-MSH의 농도가 0.1μg/mL가 되도록 처리해 72시간 동안 배양했다. 2차 배양 후 10% DMSO가 포함된 1N NaOH 0.1μL를 처리 후 1시간 동안 방치해 멜라닌을 용해시킨후 405nm 흡광도를 측정했다. 

 

2-9. 항염

염증 전달 물질 중 하나인 NO에 대한 농도를 측정해 염증 억제 효과를 확인했다. 세포 염증 실험에는 RAW 264.7 cell을 사용했으며 FBS 10%를 첨가해 제조했다. 항생물질로는 Penicillin-Streptomycin(100X)을 사용 했다. 추출물은 DMSO에 용해시켜 처리했다.

 

NO 측정을 위해 RAW 264.7을 96 well plate에 각 well 당 5.0×10 4cell 씩 seeding하여 1일간 37℃, 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양했다. 배양이 끝난 후 상층액을 제거한 뒤 와일드제라늄 추출물을 100μg/mL를 기준으로 다양한 농도로 처리하고 LPS(lipopolysaccharide, Sigma, USA)의 농도가 1μg/mL가 되도록 처리해 48시간 동안 배양했다. 2차 배양 후 상층액을 회수해 상층액 100μL와 griess reagent 100μL를 혼합해 와일드제라늄 추출물의 NO 농도를 측정했다.

 

3. 실험 결과

3-1. DPPH 라디컬 소거능

 

와일드제라늄 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 계산한 결과는 그림1과 같다. 31.25μg/mL 농도에서 27.1±2.04%, 62.5μg/mL 농도에서 47.94±1.87%, 125μg/mL 농도에서 77.42±1.87%, 250μg/mL 농도에서 95.01± 0.19%, 500μg/mL 농도에서 96.91±1.73%의 DPPH 라디칼 소거능이 나타났다. 이를 바탕으로 EC₅₀을 결과는 65.59μg/mL였다. 한편, EC₅₀을 통한 효과는 ascorbic acid는 17.44μg/mL, 본 추출물은 65.59μg/mL로 나타나 ascorbic acid와 비교 시 약 25.59%의 항산화능을 보였다.

 

민들레(Taraxacum officinal)와 비교했을 때 동일농 도인 500μg/mL에서 와일드제라늄은 96.91±1.73% 의 DPPH 라디칼 소거능이 나타나 민들레에 비해 약 1.11~1.46배 강한 항산화능을 나타낸 것으로 보인다⁶⁾.

 

그림1 DPPH radical scavenging rate of Geranium Maculatum Extract

 

 

3-2. ABTS 라디컬 소거능

와일드제라늄 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 계산한 결과는 그림2와 같다. 실험 결과, 31.25μg/mL에서 29.36±1.35%, 62.5μg/mL에서 57.65±3.69%, 125μg/ mL에서 82.31±1.69%, 250μg/mL에서 97.02±2.17%, 0.32μg/mL에서 98.48±1.87%의 ABTS 라디칼 소거능이 나타났다. EC₅₀ 계산 결과, 54.05μg/mL였다. 한편, EC₅₀을 통한 효과 비교시 ascorbic acid는 9.11μg/mL, 본추출물은 54.05μg/mL로 나타나 ascorbic acid와 비교 시약 16.86%의 항산화능을 보였다.

 

대나무잎 열수추출물과 비교한 결과, 품종에 따라 133.30~199.14μg/mL의 EC₅₀을 나타냈으며 와일드 제라늄 추출물의 EC₅₀은 54.05μg/mL로 대나무잎의 2.47~3.68배 강한 항산화능을 나타냈다⁷⁾.

 

그림2 ABTS radical scavenging rate of Geranium Maculatum Extract

 

 

3-3. FRAP

와일드제라늄 추출물의 FRAP 측정 결과, 0.097±0.004로 나타났으며 ascorbic acid의 standard curve를 이용해 와일드제라늄 추출물 1mg의 FRAP은 ascorbic acid 0.229±0.009 mg의 FRAP과 같음을 알 수 있었다.

 

3-4. 폴리페놀과 플라보노이드 함량

와일드제라늄 추출물의 폴리페놀과 플라보노이드 측정결과는 표1과 같다.

 

표1 Polyphenol and flavonoid content in Geranium Maculatum Extract

 

 

3-5. 세포 독성

와일드제라늄 추출물의 MTT assay를 이용한 세포 생존률을 측정한 결과는 표2와 같으며, RAW 264.7을 이용한 세포의 활성과 생존율을 측정한 결과는 표3과 같이 나타났다. ISO 10993-5 및 식품의약품안전처 고시 제2014-115호의 기준에 따라 모든 실험 농도에서 세포독성이 나타나지 않은 것으로 확인됐다.

 

표2 Cytotoxicity of Geranium Maculatum Extract on B16F10

 

 

표3 Cytotoxicity of Geranium Maculatum Extract on RAW 264.7

 

 

3-6. 미백 활성

와일드제라늄 추출물이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 평가하기 위해서 B16F10의 멜라닌 생성량을 측정한 결과는 표4와 같다. 상황버섯 추출물과 비교할 경우 25μg/mL에서 상황버섯은 21.46%, 와일드제라늄 추출물은 39.31%의 미백효과가 나타나 상황버섯 추출물에 비해 약 1.8배 더 높은 미백효과를 보였다⁸⁾.

 

표4 Melanin production rate of B16F10 with Geranium Maculatum Extract

 

 

3-7. 항염

와일드제라늄 추출물이 염증 전달물질에 미치는 영향을 평가하기 위해서 RAW 264.7의 NO 생성량을 측정한 결과는 표5와 같다. 민들레의 열수 추출물의 항염 효과와 비교할 경우 250μg/mL에서 7.5%의 감소를 보인데 비해 본 추출물은 100μg/mL에서 27.86±2.82% 의 염증 억제율을 나타내 낮은 농도에서도 더 높은 항염활성을 보였다⁹⁾.

 

표5 NO concentration rate of RAW 264.7 with Geranium Maculatum Extract

 

 

4. 결론

본 연구에서는 와일드제라늄 추출물이 기능성화장품 원료로서의 사용 가능성을 확인하기 위해 항산화능, 미백, 항염능, 세포독성 실험을 실시했다. 그 결과, 천연소재인 와일드제라늄 추출물이 인체에 안전하고 효과적인 기능성화장품 원료로서 활용 가능성을 확인할 수 있었다.

 

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